Schlangengift enthält Enzyme, die Carboxylesterbindungen hydrolysieren.Die Substrate für die Hydrolyse sind Phospholipide, Acetylcholin und aromatisches Acetat.Diese Enzyme umfassen drei Arten: Phospholipase, Acetylcholinesterase und aromatische Esterase.Arginin-Esterase im Schlangengift kann auch synthetisches Arginin oder Lysin hydrolysieren, aber es hydrolysiert hauptsächlich Protein-Peptid-Bindungen in der Natur, gehört also zu den Proteasen.Die hier diskutierten Enzyme wirken nur auf Estersubstrate und können auf keine Peptidbindung einwirken.Unter diesen Enzymen sind die biologischen Funktionen von Acetylcholinesterase und Phospholipase wichtiger und wurden vollständig untersucht.Einige Schlangengifte haben eine starke aromatische Esterase-Aktivität, die p-Nitrophenylethylester, a- oder p-Naphthalinacetat und Indolethylester hydrolysieren kann.Es ist noch unbekannt, ob diese Aktivität durch ein unabhängiges Enzym oder eine bekannte Nebenwirkung der Carboxylesterase hervorgerufen wird, ganz zu schweigen von ihrer biologischen Bedeutung.Als das Gift von Agkistrodon halys Japonicus mit p-Nitrophenylethylester und Indolethylester umgesetzt wurde, wurden die Hydrolysate von p-Nitrophenol und Indolphenol nicht gefunden;Im Gegenteil, wenn diese Ester mit Schlangengift der Kobra-Zhoushan-Unterart und Bungarus multicinctus-Schlangengift reagieren, werden sie schnell hydrolysiert.Es ist bekannt, dass diese Kobragifte eine starke Cholinesterase-Aktivität aufweisen, die für die Hydrolyse der obigen Substrate verantwortlich sein kann.Tatsächlich haben Mclean et al.(1971) berichteten, dass viele Schlangengifte der Cobra-Familie Indolethylester, Naphthalinethylester und Butylnaphthalinester hydrolysieren können.Diese Schlangengifte stammen von: Kobra, Schwarzhalskobra, Schwarzlippkobra, Goldkobra, Ägyptische Kobra, Königskobra, Goldkobra-Mamba, Schwarzmamba und Weißlippmamba (D. aw kennt noch die Östliche Rhombola-Klapperschlange
Das Schlangengift kann Methylindolethylester hydrolysieren, das das Substrat zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität im Serum ist, aber dieses Schlangengift zeigt keine Cholinesterase-Aktivität.Dies zeigt, dass es im Kobragift eine unbekannte Esterase gibt, die sich von der Cholinesterase unterscheidet.Um die Natur dieses Enzyms zu verstehen, sind weitere Trennarbeiten erforderlich.
1. Phospholipase A2
(I) Überblick
Phospholipase ist ein Enzym, das Glycerylphosphat hydrolysieren kann.Es gibt 5 Arten von Phospholipase in der Natur, nämlich Phospholipase A2 und Phospholipase
A., Phospholipase B, Phospholipase C und Phospholipase D. Das Schlangengift enthält hauptsächlich Phospholipase A2 (PLA2), einige wenige Schlangengifte enthalten Phospholipase B, und andere Phospholipasen kommen hauptsächlich in tierischen Geweben und Bakterien vor.Abb. 3-11-4 zeigt den Wirkort dieser Phospholipasen bei der Substrathydrolyse.
Unter den Phospholipasen wurde PLA2 genauer untersucht.Es ist möglicherweise das am besten untersuchte Enzym im Schlangengift.Sein Substrat ist die Esterbindung an der zweiten Position von Sn-3-Glycerophosphat.Dieses Enzym ist weit verbreitet in Schlangengift, Bienengift, Skorpiongift und tierischen Geweben, und PLA2 ist in Schlangengiften von vier Familien reichlich vorhanden.Da dieses Enzym rote Blutkörperchen spaltet und eine Hämolyse verursacht, wird es auch „Hämolysin“ genannt.Manche Leute nennen PLA2 auch hämolytische Lecithinase.
Ludeeke fand zuerst heraus, dass Schlangengift eine hämolytische Verbindung produzieren kann, indem es durch Enzyme auf Lecithin einwirkt.Später haben Delezenne et al.bewiesen, dass Kobragift, wenn es auf Pferdeserum oder Eigelb einwirkt, eine hämolytische Substanz bildet.Es ist jetzt bekannt, dass PLA2 direkt auf die Phospholipide der Erythrozytenmembran einwirken kann, die Struktur der Erythrozytenmembran zerstört und eine direkte Hämolyse verursacht;Es kann auch auf Serum oder zugesetztes Lecithin einwirken, um hämolytisches Lecithin zu produzieren, das auf rote Blutkörperchen einwirkt, um eine indirekte Hämolyse zu erzeugen.Obwohl PLA2 in den vier Familien von Schlangengiften reichlich vorhanden ist, ist der Gehalt an Enzymen in verschiedenen Schlangengiften leicht unterschiedlich.Klapperschlange (C
Schlangengift zeigte nur schwache PLA2-Aktivität.Tabelle 3-11-11 veranschaulicht den Vergleich der PLA2-Aktivität von 10 Hauptgiften von Giftschlangen in China.
Tabelle 3-11-11 Vergleich der Phospholipase-VIII-Aktivitäten von 10 Schlangengiften in China
Schlangengift
Fettfreisetzung
Aliphatische Säure,
Cjumol/mg)
Hämolytische Aktivität CHU50/^ g * ml)
Schlangengift
Fettsäuren freisetzen
(^Raol/mg)
Hämolytische Aktivität“ (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elf
Micracephal ophis
fünf komma eins null
Kalispallas
8. 68
zweitausendachthundert
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus Hannah
drei komma acht zwei
Ein Hundert und Vierzig
Bnugarus fasctatus
7,56
zweihundertachtzig
B. multicinctus
eins komma neun sechs
zweihundertachtzig
Viper ein Russelli
sieben Komma null drei
T, mucrosquamatus
eins komma acht fünf
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Trennung und Reinigung
Der Gehalt an PLA2 im Schlangengift ist groß und es ist stabil gegenüber Hitze, Säure, Alkali und Vergällungsmittel, sodass es leicht ist, PLA2 zu reinigen und abzutrennen.Die übliche Methode besteht darin, zuerst eine Gelfiltration des rohen Giftes durchzuführen, dann eine Ionenaustauschchromatographie durchzuführen, und der nächste Schritt kann wiederholt werden.Es sollte beachtet werden, dass die Gefriertrocknung von PLA2 nach der Ionenaustauschchromatographie keine Aggregation verursachen sollte, da der Gefriertrocknungsprozess oft die Ionenstärke im System erhöht, was ein wichtiger Faktor ist, der die Aggregation von PLA2 verursacht.Zusätzlich zu den obigen allgemeinen Verfahren wurden auch die folgenden Verfahren übernommen: ① Wells et al.② Das Substratanalogon von PLA2 wurde als Ligand für die Affinitätschromatographie verwendet.Dieser Ligand kann mit Ca2+ an PLA2 im Schlangengift binden.Als Elutionsmittel wird meist EDTA verwendet.Nachdem Ca2+ entfernt wurde, nimmt die Affinität zwischen PLA2 und dem Liganden ab und es kann vom Liganden dissoziiert werden.Andere verwenden 30 % organische Lösung oder 6 mol/L Harnstoff als Elutionsmittel.③ Hydrophobe Chromatographie wurde mit PheiiylSephar0SeCL-4B durchgeführt, um Spuren von PLA2 in Cardiotoxin zu entfernen.④ Anti-PLA2-Antikörper wurde als Ligand verwendet, um eine Affinitätschromatographie an PLA2 durchzuführen.
Bisher wurde eine große Anzahl von Schlangengift PLAZ gereinigt.Tuet al.(1977) listete vor 1975 aus Schlangengift gereinigtes PLA2 auf. In den letzten Jahren wurde jedes Jahr eine große Anzahl von Artikeln über die Trennung und Reinigung von PLA2 veröffentlicht.Hier konzentrieren wir uns auf die Trennung und Reinigung von PLA durch chinesische Gelehrte.
Chen Yuancong et al.(1981) trennten aus dem Gift von Agkistrodon halys Pallas in Zhejiang drei PLA2-Spezies, die nach ihren isoelektrischen Punkten in saures, neutrales und alkalisches PLA2 eingeteilt werden können.Entsprechend seiner Toxizität ist neutraleres PLA2 toxischer, das als präsynaptisches Neurotoxin Agkistrodotoxin identifiziert wurde.Alkalisches PLA2 ist weniger toxisch und saures PLA2 hat fast keine Toxizität.Wu Xiangfuet al.(1984) verglichen die Eigenschaften von drei PLA2s, einschließlich Molekulargewicht, Aminosäurezusammensetzung, N-Terminus, isoelektrischer Punkt, thermische Stabilität, Enzymaktivität, Toxizität und hämolytische Aktivität.Die Ergebnisse zeigten, dass sie ein ähnliches Molekulargewicht und eine ähnliche thermische Stabilität aufwiesen, aber signifikante Unterschiede in anderen Aspekten aufwiesen.Hinsichtlich der Enzymaktivität war die saure Enzymaktivität höher als die alkalische Enzymaktivität;Die hämolytische Wirkung von alkalischem Enzym auf rote Blutkörperchen von Ratten war am stärksten, gefolgt von neutralem Enzym und kaum hämolysiertem saurem Enzym.Daher wird spekuliert, dass die hämolytische Wirkung von PLAZ mit der Ladung des PLA2-Moleküls zusammenhängt.Zhang Jingkanget al.(1981) haben Agkistrodotoxin-Kristalle hergestellt.Tu Guangliang et al.(1983) berichteten, dass ein toxisches PLA mit einem isoelektrischen Punkt von 7,6 aus dem Gift von Vipera rotundus aus Fujian isoliert und gereinigt wurde, und seine physikalischen und chemischen Eigenschaften, Aminosäurezusammensetzung und die Sequenz von 22 Aminosäureresten am N -terminal bestimmt wurden.Li Yueshenget al.(1985) isolierten und reinigten ein weiteres PLA2 aus dem Gift von Viper rotundus in Fujian.Die Untereinheit des PLA2* ist 13 800, der isoelektrische Punkt ist 10,4 und die spezifische Aktivität ist 35/xnioI/miri mg。 Mit Lecithin als Substrat beträgt der optimale pH-Wert des Enzyms 8,0 und die optimale Temperatur 65 °C • LD5 intravenös in Mäuse injiziert.Sie beträgt 0,5 ± 0,12 mg/kg.Dieses Enzym hat offensichtliche gerinnungshemmende und hämolytische Wirkungen.Das toxische PLA2-Molekül besteht aus 123 Resten von 18 Arten von Aminosäuren.Das Molekül ist reich an Cystein (14), Asparaginsäure (14) und Glycin (12), enthält aber nur ein Methionin, und sein N-Terminus ist ein Serinrest.Verglichen mit von Tuguang isoliertem PLA2 sind das Molekulargewicht und die Anzahl der Aminosäurereste der beiden Isoenzyme sehr ähnlich, und die Aminosäurezusammensetzung ist auch sehr ähnlich, aber die Anzahl der Asparaginsäure- und Prolinreste ist etwas unterschiedlich.Guangxi-Königskobra-Schlangengift enthält reichhaltiges PLA2.Shu Yuyanet al.(1989) isolierten ein PLA2 aus dem Gift, das eine 3,6-mal höhere spezifische Aktivität als das ursprüngliche Gift, ein Molekulargewicht von 13000, eine Zusammensetzung von 122 Aminosäureresten, einen isoelektrischen Punkt von 8,9 und eine gute thermische Stabilität aufweist.Aus der elektronenmikroskopischen Beobachtung der Wirkung von basischem PLA2 auf rote Blutkörperchen ist ersichtlich, dass es eine offensichtliche Wirkung auf die Membran menschlicher roter Blutkörperchen hat, aber keine offensichtliche Wirkung auf rote Blutkörperchen von Ziegen hat.Dieses PLA2 hat eine offensichtliche Verzögerungswirkung auf die elektrophoretische Geschwindigkeit von roten Blutkörperchen bei Menschen, Ziegen, Kaninchen und Meerschweinchen.Chenet al.Dieses Enzym kann die durch ADP, Kollagen und Natriumarachidonsäure induzierte Blutplättchenaggregation hemmen.Wenn die PLA2-Konzentration 10/xg/ml ~ 100 ml/ml beträgt, wird die Blutplättchenaggregation vollständig gehemmt.Wenn gewaschene Blutplättchen als Materialien verwendet wurden, konnte PLA2 die Aggregation bei einer Konzentration von 20 mg/ml nicht hemmen.Aspirin ist ein Inhibitor der Cyclooxygenase, die die Wirkung von PLA2 auf Blutplättchen hemmen kann.PLA2 kann die Blutplättchenaggregation hemmen, indem es Arachidonsäure hydrolysiert, um Thromboxan A2 zu synthetisieren.Die Lösungskonformation von PLA2, das vom Gift von Agkistrodon halys Pallas in der Provinz Zhejiang produziert wird, wurde mittels Circulardichroismus, Fluoreszenz und UV-Absorption untersucht.Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Hauptkettenkonformation dieses Enzyms ähnlich der der gleichen Art von Enzym anderer Arten und Gattungen war, die Skelettkonformation eine gute Wärmebeständigkeit aufwies und die strukturelle Veränderung in einer sauren Umgebung reversibel war.Die Kombination aus Aktivator Ca2+ und Enzym beeinflusst die Umgebung von Tryptophanresten nicht, während der Inhibitor Zn2+ das Gegenteil bewirkt.Die Art und Weise, in der der pH-Wert der Lösung die Enzymaktivität beeinflusst, unterscheidet sich von den obigen Reagenzien.
Im Prozess der PLA2-Reinigung von Schlangengift besteht ein offensichtliches Phänomen darin, dass ein Schlangengift zwei oder mehr PLA2-Elutionspeaks enthält.Dieses Phänomen kann wie folgt erklärt werden: ① aufgrund der Existenz von Isoenzymen;② Eine Art von PLA2 wird zu einer Vielzahl von PLA2-Mischungen mit unterschiedlichen Molekulargewichten polymerisiert, von denen die meisten im Bereich von 9.000 bis 40.000 liegen;③ Die Kombination von PLA2 und anderen Schlangengiftkomponenten erschwert PLA2;④ Da die Amidbindung in PLA2 hydrolysiert wird, ändert sich die Ladung.① und ② sind weit verbreitet, mit wenigen Ausnahmen, wie PLA2 in CrWa/w-Schlangengift
Es gibt zwei Situationen: ① und ②.Die dritte Bedingung wurde in PLA2 im Gift der folgenden Schlangen gefunden: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a^>er, Palästinensische Viper, Sandviper und Schreckliche Klapperschlange km。
Das Ergebnis von Fall ④ bewirkt, dass sich die Migrationsgeschwindigkeit von PLA2 während der Elektrophorese ändert, aber die Aminosäurezusammensetzung ändert sich nicht.Peptide können durch Hydrolyse aufgebrochen werden, aber im Allgemeinen sind sie immer noch durch Disulfidbindungen aneinander gebunden.Das Gift der Östlichen Grubenklapperschlange enthält zwei Formen von PLA2, genannt Typ-a- bzw. Typ-p-PLA2.Der Unterschied zwischen diesen beiden Arten von PLA2 besteht nur in einer Aminosäure, dh Glutamin in einem PLA2-Molekül wird durch Glutaminsäure im anderen PLA2-Molekül ersetzt.Obwohl der genaue Grund für diesen Unterschied nicht klar ist, wird allgemein angenommen, dass er mit der Desaminierung von PLA2 zusammenhängt.Wenn PLA2 im Gift der palästinensischen Viper mit dem rohen Gift warm gehalten wird, werden die Endgruppen in ihren Enzymmolekülen mehr als zuvor.Aus C PLA2 isoliert aus Schlangengift hat zwei unterschiedliche N-terminale Enden und sein Molekulargewicht beträgt 30000. Dieses Phänomen kann durch das asymmetrische Dimer von PLA2 verursacht werden, das dem symmetrischen Dimer ähnlich ist, das von PLA2 im Gift der östlichen Diamantrücken-Klapperschlange gebildet wird und Western Diamondback Klapperschlange.Die asiatische Kobra besteht aus vielen Unterarten, von denen einige nicht sehr eindeutig klassifiziert sind.Zum Beispiel wird heute die sogenannte Unterart Cobra Outer Caspian anerkannt
Es sollte der Äußeren Kaspischen Meereskobra zugeschrieben werden.Da es viele Unterarten gibt und diese untereinander gemischt sind, variiert die Zusammensetzung des Schlangengiftes aufgrund unterschiedlicher Quellen stark und auch der Gehalt an PLA2-Isozymen ist hoch.Zum Beispiel Kobragift
Mindestens 9 Arten von PLA2-Isozymen von r ^ ll-Spezies wurden gefunden, und 7 Arten von PLA2-Isozymen wurden im Gift der Kobra-Unterart Caspian gefunden.Durkinet al.(1981) untersuchten den PLA2-Gehalt und die Anzahl an Isoenzymen in verschiedenen Schlangengiften, darunter 18 Kobragifte, 3 Mambagifte, 5 Vipergifte, 16 Klapperschlangengifte und 3 Seeschlangengifte.Im Allgemeinen ist die PLA2-Aktivität von Kobragift hoch, mit vielen Isozymen.Die PLA2-Aktivität und die Isozyme von Viperngift sind mittel.Die PLA2-Aktivität von Mamba- und Klapperschlangengift ist sehr gering oder keine PLA2-Aktivität.Die PLA2-Aktivität von Seeschlangengift ist ebenfalls gering.
In den letzten Jahren wurde nicht berichtet, dass PLA2 in Schlangengift in Form von aktivem Dimer vorliegt, wie z. B. in der östlichen Rhombophora-Klapperschlange (C. Schlangengift enthält Typ-a- und Typ-P-PLA2, die beide aus zwei identischen Untereinheiten bestehen , und nur Dimerase hat
Aktivität.Shenet al.schlugen auch vor, dass nur das Dimer von PLA2 des Schlangengifts die aktive Form des Enzyms ist.Die Untersuchung der räumlichen Struktur beweist auch, dass PLA2 der Western Diamondback Klapperschlange in Form von Dimer vorliegt.Fischfressende Verbindung
Es gibt zwei verschiedene PLA ^ Ei und E2 von Schlangengift, in denen 仏 in Form eines Dimers vorliegt, das Dimer aktiv ist und sein dissoziiertes Monomer inaktiv ist.Lu Yinghuaet al.(1980) untersuchten weiter die physikalischen und chemischen Eigenschaften und die Reaktionskinetik von E. Jayanthi et al.(1989) isolierten ein basisches PLA2 (VRVPL-V) aus dem Gift der Viper.Das Molekulargewicht des Monomers PLA2 beträgt 10000, was tödliche, gerinnungshemmende und ödemartige Wirkungen hat.Das Enzym kann Polymere mit unterschiedlichen Molekulargewichten unter der Bedingung eines pH-Werts von 4,8 polymerisieren, und der Polymerisationsgrad und das Molekulargewicht der Polymere nehmen mit steigender Temperatur zu.Das Molekulargewicht des bei 96 °C erzeugten Polymers beträgt 53.100, und die PLA2-Aktivität dieses Polymers nimmt um zwei zu
Postzeit: 18. November 2022